der Siegreiche主导重要的大学改革，争取学术自由。
=== 宗教改革时期 ===
尽管马丁·路德于1517年倡导宗教改革，海德堡大学最初未受此影响。不久，大学内路德的支持者将该校变成了德意志西南部的宗教改革中心。选帝侯奥托·亨利改宗新教后，于1556年将大学改造为一所具有加尔文教精神的学校，并延续先前的大学改革。
16世纪后半叶，选帝侯弗里德里希三世更将大学打造为欧洲学术与文化中心，当时的海德堡更被视为德意志的日内瓦，成为加尔文教派重镇，吸引众多欧洲各国学者前来讲学。1563年，由选帝侯弗里德里希三世主持，汇集了神学系教授和学者思想精华的《海德堡教理问答》编撰而成。除加尔文主义盛行外，后人文主义亦于16世纪末兴起，成为了校内仅次于加尔文主义的思想，知名学者如 Paul Schede、Jan Gruter、Martin Opitz、Julius Wilhelm Zincgref及马特乌斯·梅里安。这一黄金时期延续至1618年三十年战争。
=== 三十年战争时期 ===
三十年战争重创海德堡大学，教学几经中断。1622年大学内举世闻名的帕勒提那图书馆遭洗劫，珍贵书籍文献被掠夺至罗马献给教宗。三十年战争后，大学重建工作又因1693年路易十四指挥法国军队摧毁海德堡而陷于停滞。
=== 18世纪 ===
18世纪时，海德堡大学的光芒一度黯淡，发生在校内的反宗教改革，使得海德堡大学丧失了先前具有的崇尚学术自由、大胆质疑、对旧体系批判和抗争的新教精神。大学教职被耶稣会所把持，昔日举世闻名的欧洲学术和文化中心一去不返，取而代之的是呆板、繁琐、枯燥、抹杀一切新思想和独立精神、不得阅读教会罗列的禁书、片面追求华而不实的布道仪式和巴洛克装饰的教会专属学校。
18世纪末耶稣会被教宗解散后，大学于1773年归遣使会所有。财政上的困境、思想上的禁锢，外加18世纪末不断的革命战争使海德堡大学名声跌落谷底。1712年至1735年，选帝侯任命约翰·布伦尼（Johann Adam Breunig）为建筑师，于今日的大学广场上兴建一座行宫，选帝侯之后将行宫赠予海德堡大学，该建筑今日被称为老大学。
=== 19世纪 ===
在1806年拿破仑主导的德意志采邑调解中，海德堡并入巴登大公国，开始了大学历史上新的一页。海德堡大学重新改组后，其财务改由国家财政支持。为纪念巴登大公爵卡尔·弗里德里希的贡献，其名字被加于海德堡大学校名之内，从此大学的全名为“鲁普雷希特-卡尔斯-海德堡大学”，或以拉丁文称为Ruperto …
